無菌操作臺標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程

1.目的：

建立無菌檢查的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，確保檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.范圍：

適用于本廠質(zhì)監(jiān)科化驗(yàn)室對本廠生產(chǎn)的注射劑進(jìn)行無菌檢查。

3.責(zé)任：

化驗(yàn)員有責(zé)任按本操作規(guī)程操作，并對檢驗(yàn)結(jié)果負(fù)責(zé)。

4.定義：

無菌檢查法系指檢查藥品是否無菌的一種方法。

5.內(nèi)容：

5.1無菌操作設(shè)備：

無菌操作室或超凈工作臺，無菌衣、口罩、帽子、消毒鞋、酒精燈等。

5.1.1無菌室分無菌操作室和緩沖間。在緩沖間內(nèi)應(yīng)有洗手盆、干手器、無菌衣放置架及掛鉤、拖鞋等。無菌操作室應(yīng)具有空氣除菌過濾的層流裝置，局部潔凈度100級超凈工作臺。緩沖間及操作室內(nèi)均設(shè)置能達(dá)到空氣消毒的紫外光燈和照明燈，操作室或工作臺應(yīng)保持空氣正壓。

5.1.2無菌室應(yīng)每周和每次操作前用0.1％新潔爾滅或2％甲酚液擦拭操作臺及可能污染的死角，開動無菌空氣過濾器及紫外光燈殺菌1小時(shí)。在每次操作完畢，同樣用2％甲酚或0.1％新潔爾滅溶液擦拭工作臺面，用紫外光燈殺菌半小時(shí)。

5.1.3無菌室的無菌程度檢查：無菌室在消毒處理后，無菌試驗(yàn)前及操作過程中需檢查空氣中菌落數(shù)。取直徑90mm雙碟，在接種室內(nèi)點(diǎn)燃酒精燈，在酒精燈旁，以無菌操作，將雙碟半開注入溶化的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基約20ml，制成平板：在35-37℃預(yù)培養(yǎng)48小時(shí)，證明無菌后將3個(gè)平板以無菌方式帶入無菌操作間的潔凈區(qū)域左、中、右各放1個(gè)；打開碟蓋扣置，平板在空氣中暴露30分鐘后將蓋蓋好，置35-37℃培養(yǎng)48小時(shí)，取出檢查，3個(gè)平板上生長的菌落數(shù)相加總數(shù)不得超過10個(gè)。

無菌操作臺面或超凈工作臺應(yīng)定期請有關(guān)部門檢測其潔凈度，應(yīng)達(dá)到100級（一般用塵埃粒子計(jì)數(shù)儀），檢測塵埃粒徑≤5μm的粒數(shù)不得超過3.5個(gè)／升；空氣流量應(yīng)控制在0.75-1.0m3/s；細(xì)菌菌落數(shù)平均<1個(gè)，可根據(jù)無菌狀況定期置換過濾器。

5.1.4無菌室內(nèi)應(yīng)準(zhǔn)備好盛有消毒用5％甲酚的玻璃缸、酒精燈、火柴、鑷子、75％酒精棉及拖鞋等。

5.2儀器、用具：

5.2.1真空泵、恒溫培養(yǎng)箱、生物顯微鏡、托盤天平（精度0.1g）、抽濾瓶（500ml）、???三角瓶（100、500 ml）、移液管（1、10ml）、注射器（要求規(guī)格）、試管、雙碟（9cm）、注射針、鑷子、剪刀、白金耳、橡皮管、紗布、棉花（原棉）、不銹鋼吸管筒、接種環(huán)、微孔濾膜（直徑約5cm），孔徑應(yīng)在0.45±0.02μm )載玻片、灑精燈、取樣勺、吸耳球、噴霧瓶。

5.2.2用具的包扎：

5.2.2.1移液管

在移液管上端管內(nèi),松松地塞進(jìn)少許原棉,然后放入不銹鋼滅菌筒內(nèi)。

5.2.2.2試管

在管口塞上紗布棉塞。

5.2.2.3無菌衣、褲、帽、口罩

將洗凈的衣褲、帽子、口罩配套后裝入布袋，扎緊袋口，再用牛皮紙包好。

5.2.2.4注射器

洗滌干凈的注射器及注射針頭裝配好后，放入墊有紗布的帶蓋容器內(nèi)（飯盒）一層層放好，上面蓋上紗布，然后蓋上容器的蓋子，用牛皮紙包好。

5.2.2.5濾器

將檢驗(yàn)合格后微孔濾膜先有水中浸泡濕潤，取出后固定在細(xì)菌過濾器的濾板上，濾板下、濾膜上均用耐高溫墊圈墊好，上好濾器。在滅菌前濾器的螺勿擰太緊，濾器上口用8層紗布及牛皮紙包扎，裝妥后放入容器內(nèi)，再將盛濾器的容器蓋好蓋子，用牛皮紙包扎。

5.2.3用具的滅菌：

將包扎好的用具，在121±0.5℃蒸汽滅菌柜中滅菌30分鐘，物品取出時(shí)切勿立即置冷處，以免急速冷卻滅菌物品內(nèi)蒸汽冷凝造成負(fù)壓，易致染菌，應(yīng)置溫箱或或加溫烘干。

5.3培養(yǎng)基、試劑：

5.3.1一般采用商品干燥培養(yǎng)基，臨用時(shí)按照使用說明書進(jìn)行配制，需注意培養(yǎng)基的pH值應(yīng)符合規(guī)定，否則必須校正后，滅菌使用。

使用前，按要求分裝滅菌好的細(xì)菌培養(yǎng)基須經(jīng)30-35℃培養(yǎng)48小時(shí)，真菌培養(yǎng)基須經(jīng)20-25℃培養(yǎng)72小時(shí)，證明無菌生長后方可使用。

制備的需氣菌、厭氣菌培養(yǎng)基應(yīng)半個(gè)月內(nèi)用完，在供試品接種前，培養(yǎng)基指示劑氧化層的顏色不得超過培養(yǎng)基深度約1/5，否則須經(jīng)水浴煮沸加熱，只限加熱一次。

5.3.2革蘭氏碘液：

先用3-5ml蒸餾水溶解2.0g碘化鉀，再加入1.0g碘片，攪拌溶解后，加蒸餾水稀釋至300ml，搖勻。置密閉棕色瓶中備用。

5.3.3結(jié)晶紫染色液：

將結(jié)紫1.0g溶解于20ml95%乙醇中后，與80ml1%草酸銨溶液相混合，靜置48小時(shí)使用。此液穩(wěn)定，置密閉的棕色瓶中可儲存數(shù)月。

5.3.4沙黃染色液：

將0.2g沙黃溶解于10ml95%乙醇中，待完全溶解后再加蒸餾水至100ml。

5.3.5生理鹽水：

稱取9g氯化鈉，加水1000ml溶解，分裝后于121±0.5℃濕熱滅菌30分鐘。供作稀釋劑用。

5.3.6 75%乙醇

量取無水乙醇75ml,加水稀釋至100ml，搖勻，即得。

5.3.7 0.1%新潔爾滅：

量取5%新潔爾滅20ml，加水稀釋至約1000ml，搖勻，即得。

5.4培養(yǎng)基靈敏度檢查：

5.4.1新購的干燥培養(yǎng)基或采用不同牌號原材料的新鮮培養(yǎng)基，其質(zhì)量均應(yīng)符合靈敏度檢查要求。

(1)取藤黃微球菌[Micrococcus luteus? CMCC（B）? 28001］的營養(yǎng)瓊脂斜面和白色念珠菌[Candida? albicans? CMCC（F）98001］的真菌培養(yǎng)基瓊脂斜面的新鮮培養(yǎng)物，分別用0.9%無菌氯化鈉溶液制成均勻的菌懸液；取生孢梭菌[Clostridium? sporogenes? CMCC（B）64941]不含瓊脂的需氣、厭氣培養(yǎng)基新鮮培養(yǎng)物，用滅菌毛細(xì)管將其吸至滅菌離心管內(nèi)，離心，棄去上清液，沉淀菌體用0.9%無菌氯化鈉溶液制成均勻菌懸液。然后以10倍系列稀釋后，制成1ml中含10-100個(gè)菌并計(jì)數(shù)。

(2)取藤黃微球菌、生孢梭菌的需氣、厭氣培養(yǎng)基新鮮培養(yǎng)物，白色念珠菌的真菌培養(yǎng)基瓊脂斜面的新鮮培養(yǎng)物，取接種至霉菌培養(yǎng)基內(nèi)，20-25℃用0.9%無菌氯化鈉溶液作10倍稀釋，制成1ml中含10-100個(gè)菌并計(jì)數(shù)。

將藤黃微球菌的上述(1)或(2)的稀釋液各1ml，分別接種至每管裝量為9ml的需氣、厭氣菌培養(yǎng)基3管，生孢梭菌的上述(1)或(2)的稀釋液各1ml，分別接種至每管裝量為12ml的需氣、厭氣菌培養(yǎng)基3管，白色念珠菌的上述(1)或(2)的稀釋液各1ml，接種至每管裝量為9ml的真菌培養(yǎng)基3管，以未接種的培養(yǎng)基作對照，按規(guī)定的溫度培養(yǎng)5天并逐日記錄結(jié)果。

結(jié)果判定：以每株菌接種后的培養(yǎng)基不得少于2管呈現(xiàn)生長，即該培養(yǎng)基的靈敏度檢查符合要求。

5.4.2配制的培養(yǎng)基應(yīng)在涼暗處保存，一般不得超過2周，臨用前細(xì)菌和霉菌培養(yǎng)基分別經(jīng)30-35℃和20-25℃培養(yǎng)不少于48小時(shí)和72小時(shí)，證明無菌生長后方可使用。

5.4.3需氣菌、厭氣菌培養(yǎng)基在試管中裝量高度不得少于7Cm，其指示劑氧化層不得超過培養(yǎng)基深度的1／5，否則須經(jīng)水浴煮沸10分鐘，但只限加熱一次。

無菌試驗(yàn)培養(yǎng)時(shí)間結(jié)束時(shí)，指示劑氧化層應(yīng)不超過培養(yǎng)基深度的1／2。

5.5對照用菌液的制備：

5.5.1試驗(yàn)用菌種、菌種的復(fù)蘇、菌種的接種與保存等均應(yīng)按照“抗生素微生物檢定法”標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程項(xiàng)下操作。

5.5.2金黃色葡萄球菌菌液用接種環(huán)取金黃色葡萄球菌[Staphy-lococcus aureus? CMCC（B）26003]的營養(yǎng)瓊脂斜面新鮮培養(yǎng)物少許，接種至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，在30-35℃培養(yǎng)16-18小時(shí)后，用滅菌生理鹽水稀釋成1:106

5.5.3生孢梭菌菌液用接種環(huán)取生孢梭菌[CMCC（B）64941]的需氣菌、厭氣菌培養(yǎng)基新鮮培養(yǎng)物1白金耳，接種至相同培養(yǎng)基內(nèi)，在30-35℃培養(yǎng)18-24小時(shí)后，用滅菌生理鹽水稀釋成1:106。

5.5.4白色念珠菌菌液用接種環(huán)取白色念珠菌[CMCC（F）98001]的真菌瓊脂培養(yǎng)基斜面新鮮培養(yǎng)物1白金耳，接種至真菌培養(yǎng)基內(nèi)，在20-25℃培養(yǎng)24小時(shí)后，用滅菌生理鹽水稀釋成1:105。

5.5.5上述制備的菌液，一般當(dāng)日使用。

5.6進(jìn)入無菌室的操作要點(diǎn)：

5.6.1根據(jù)試驗(yàn)程序,將用具物品搬入緩沖間,打開紫外光燈和空氣過濾裝置并使其工作1小時(shí)以上。

5.6.2操作人員用肥皂水刷洗雙手,關(guān)閉緩沖間紫外光燈,進(jìn)入緩沖間內(nèi),關(guān)閉第一層門,用2%來蘇爾或0.1%新潔爾滅溶液洗雙手,用消毒毛巾擦干,換上無菌衣、帽、口罩及消毒鞋。

5.6.3關(guān)閉無菌室內(nèi)紫外光燈，進(jìn)入第二層門并將用具搬至無菌室內(nèi)，關(guān)閉無菌室門。

5.6.4凡進(jìn)入無菌室后不應(yīng)再外出取物品，因此，在每次試驗(yàn)中所用物品必須計(jì)劃好，并準(zhǔn)備好備用物品。從進(jìn)入第一層門直至無菌室內(nèi)，隨操作人員的進(jìn)入應(yīng)噴霧2%來蘇爾或0.1 %新潔爾滅溶液。

5.7檢查法：

5.7.1無菌檢查法包括：直接接種法和薄膜過濾法。前者適用于非抗菌作用的供試品；后者適用于有抗菌作用的或大容量的供試品。

5.7.2操作時(shí)，應(yīng)先用0.1%新潔爾滅浸泡或擦拭容器表面后，以無菌的方法取內(nèi)容物。

5.7.3凡無菌檢查中，均應(yīng)取相應(yīng)溶劑和稀釋劑同法操作，作陰性對照。

5.7.4供試品制備：

用滅菌鑷取出注射器，在火焰旁將針芯插入針管并安上針頭，蓋為橡皮塞時(shí)，用注射器在已消毒好的橡皮塞中心位置刺入吸取藥液。按規(guī)定須稀釋或滅活的供試品，可直接或?qū)⑵績?nèi)供試液抽出至滅菌玻璃容器內(nèi)進(jìn)行滅活處理并稀釋至規(guī)定的體積和濃度；抽取瓶中內(nèi)容液體時(shí)，應(yīng)將供試品倒置并使針頭在液面下。

5.7.5直接接種法：

按規(guī)定量取供試品，以無菌操作將該供試品分別接種于需氣菌、厭氣菌培養(yǎng)基6管，其中1管接種金黃色葡萄球菌液1ml，作陽性對照，另接種于真菌培養(yǎng)基5管。輕輕搖動，使供試品與培養(yǎng)基混合。需氣菌、厭氣菌培養(yǎng)基管置30-35℃、真菌培養(yǎng)基管置20-25℃培養(yǎng)7日。在培養(yǎng)期間應(yīng)逐日觀察并記錄是否有菌生長。陽性對照管在24小時(shí)內(nèi)應(yīng)有菌生長，如在加入供試品后，培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁，培養(yǎng)7天后，不能從外觀上判斷有無微生物生長，可取該培養(yǎng)液適量轉(zhuǎn)種至同種新鮮培養(yǎng)基中或斜面培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)菌培養(yǎng)2日，真菌培養(yǎng)3日，觀察是否再出現(xiàn)渾濁或斜面有無菌生長，或用接種環(huán)取培養(yǎng)液涂片，染色，用顯微鏡觀察是否有菌。

5.7.6薄膜過濾法：

將微孔濾膜過濾裝置、抽濾瓶、排氣管與真空泵相連，真空泵可置無菌室外。

取規(guī)定量供試品，按規(guī)定的方法處理后，加入0.9%無菌氯化鈉溶液100ml中，混合后，通過裝有孔徑不大于0.45μm的薄膜過濾器，減壓抽干后，用0.9%無菌氯化鈉溶液沖洗濾膜3次，每次至少100ml，取出濾膜分成3等份，分別加入上述二種培養(yǎng)基中，按規(guī)定溫度和時(shí)間培養(yǎng)。陽性對照管應(yīng)根據(jù)供試品特性加入相應(yīng)對照菌液1ml（抗細(xì)菌藥物，以金黃色葡萄球菌為對照菌；抗厭氧菌藥物，以生孢梭菌為對照菌；抗真菌藥物，以白色念珠菌為對照菌）。陽性對照管細(xì)菌應(yīng)在培養(yǎng)24-48小時(shí)，真菌應(yīng)在培養(yǎng)24-72小時(shí)有菌生長。

5.8結(jié)果判斷：

當(dāng)陽性對照管顯渾濁并確有菌生長，陰性對照管呈陰性時(shí)，可根據(jù)觀察所得的結(jié)果判定：如需氣菌、厭氣菌及真菌培養(yǎng)基管均為澄清或雖渾濁但經(jīng)證明并非有菌生長，均應(yīng)判為供試品合格；如需氣菌、厭氣菌及真菌培養(yǎng)基管中任何1管顯渾濁并確證有菌生長，應(yīng)重新取2倍量供試品，分別依法復(fù)試，除陽性對照管外，其他各管均不得有菌生長，否則應(yīng)判為供試品不合格。

6培訓(xùn)

6.1培訓(xùn)對象：化驗(yàn)員。

6.2培訓(xùn)時(shí)間：二小時(shí)。

7記錄

記錄名稱???????????????保存部門???????????????保存時(shí)間

無菌檢驗(yàn)記錄??????????????質(zhì)監(jiān)科????????????藥品有效期后一年

QF-01-007-00

無菌檢驗(yàn)記錄

品???名：??????????????????????批???號：

規(guī)???格：??????????????????????檢驗(yàn)日期：?????? ?年?????月?????日

復(fù)核人：?????????? ????????????????????檢驗(yàn)人：