微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)

班級(jí)：??????????????姓名：　　　　　??編輯：吳定

【課程目標(biāo)】

???了解培養(yǎng)基的基礎(chǔ)知識(shí)，進(jìn)行微生物培養(yǎng)和無菌技術(shù)的操作。

【課題重點(diǎn)及難點(diǎn)】

???無菌技術(shù)的操作

【知識(shí)梳理】

一、基礎(chǔ)知識(shí)

1、培養(yǎng)基

①　概念：人們按照微生物對(duì)????????的不同需求，配制出供其????????的營養(yǎng)基質(zhì)叫培養(yǎng)基?？煞譃?? ?培養(yǎng)基和???????培養(yǎng)基。

②　營養(yǎng)構(gòu)成：各種培養(yǎng)基一般都含有???、?????、?????和??????，此外還要滿足微生物生長(zhǎng)對(duì)????、?以及??????的要求。

③　培養(yǎng)乳酸桿菌時(shí)需在培養(yǎng)基中添加???????、培養(yǎng)霉菌時(shí)需將培養(yǎng)基PH調(diào)至?????、培養(yǎng)細(xì)菌時(shí)需將pH調(diào)至???????????????、培養(yǎng)厭氧微生物則需提供????????條件。

2、無菌技術(shù)

①　獲得純凈培養(yǎng)物的關(guān)鍵是?????????????????????????。

②　無菌技術(shù)：（1）對(duì)實(shí)驗(yàn)操作空間、操作者的衣著和手進(jìn)行??????????????；

（2）將培養(yǎng)器皿、接種用具和培養(yǎng)基等器具進(jìn)行??????????；

（3）為避免周圍微生物污染，實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在???????????????????旁進(jìn)行；

（4）避免已滅菌處理的材料用具與????????????????????相接觸。

③　消毒方法：（1）日常生活經(jīng)常用到的是??????????????消毒法；

（2）對(duì)一些不耐高溫的液體，則使用??????消毒法；

（3）對(duì)接種室、接種箱或超凈工作臺(tái)首先噴灑石炭酸或煤酚皂等溶液以增強(qiáng)消毒效果，然后使用紫外線進(jìn)行物理消毒。

（4）實(shí)驗(yàn)操作者的雙手使用?????????進(jìn)行消毒；

（5）飲水水源用氯氣進(jìn)行消毒。

④　滅菌方法：（1）接種環(huán)、接種針、試管口等使用????????滅菌法，對(duì)接種環(huán)滅菌時(shí)要用酒精燈火焰的???????????層灼燒。

（2）玻璃器皿、金屬用具等使用????????滅菌法，所用器械是????????????????；

（3）培養(yǎng)基、無菌水等使用??????????????，所用器械是????????????????????。

（4）表面滅菌和空氣滅菌等使用紫外線滅菌法，所用器械是紫外燈。

【補(bǔ)充】請(qǐng)結(jié)合P85附錄4填空

利用干熱滅菌箱對(duì)玻璃器皿滅菌時(shí)物品不能擺得太擠，目的是????????????????????????????????。

物品裝入高壓蒸汽滅菌鍋滅菌后，要首先打開排氣閥，煮沸并排除鍋內(nèi)冷空氣，其目的是有利于鍋內(nèi)溫度升高；隨后關(guān)閉排氣閥繼續(xù)加熱，氣壓升至?????????，溫度為??????????，并維持15～30 min；最后切斷熱源，使溫度自然降溫，氣壓務(wù)必降至???時(shí)打開鍋蓋，其目的是防止容器中的液體暴沸???。

二、實(shí)驗(yàn)操作

1、制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基

（1）基本步驟：?????→?????→?????（→調(diào)pH）→?????→倒平板[每個(gè)步驟都要清楚掌握！]

（2）倒平板的過程

①在火焰旁右手拿???????????????，左手???????????；

②使錐形瓶的瓶口??????????????????；

③左手將培養(yǎng)皿???????????????????????，右手???????????????????????，左手立刻蓋上皿蓋。

④待平板冷卻凝固后，將平板????????????????????。

（3）注意事項(xiàng)：

①待培養(yǎng)基冷卻到???????時(shí)才能用來倒平板，溫度過高會(huì)燙手，過低培養(yǎng)基又會(huì)凝固。

②整個(gè)操作在酒精燈火焰旁進(jìn)行，避免雜菌污染。

③平板需???，這樣既可使培養(yǎng)基表面的水分更好地?fù)]發(fā)，又可防止培養(yǎng)皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。

2、純化大腸桿菌

（1）原理：在培養(yǎng)基上將細(xì)菌??????????????成單個(gè)細(xì)胞，使其長(zhǎng)成單個(gè)菌落，這個(gè)菌落就是一個(gè)純化的細(xì)菌菌落。

（2）方法：微生物接種的最常用方法是?????????和??????????????，另外還有穿刺接種和斜面接種等。

（3）平板劃線操作及注意事項(xiàng)：

平板劃線法是??????????????????????????????????????????????????的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面。

其操作步驟是：

①將???????在酒精燈火焰上灼燒直至??????????。

②在酒精燈火焰旁冷卻接種環(huán)，并打開盛有菌液的試管的棉塞。

③將菌種試管口通過火焰達(dá)到????????????的目的。

④將冷卻的接種環(huán)伸入到???????????????????????。

⑤將菌種試管口再次通過火焰后塞上棉塞。

⑥將皿蓋打開一條縫隙，把接種環(huán)???????????????????????????????，蓋上皿蓋，不要?jiǎng)澠婆囵B(yǎng)基。

⑦灼燒接種環(huán)，冷卻后從? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 劃線。重復(fù)上述過程，完成三、四、五區(qū)域內(nèi)劃線。注意不要將??????????????????????????????????相連。

⑧將平板?????，??????????????????培養(yǎng)。

注意事項(xiàng)：

①操作的第一步及每次劃線之前都需要將接種環(huán)灼燒滅菌，劃線操作結(jié)束時(shí)仍需灼燒接種環(huán)，每次灼燒的目的如下表：

②灼燒接種環(huán)之后，要冷卻后才能再進(jìn)行劃線，以免????????????????。

③劃線時(shí)最后一區(qū)域不要與第一區(qū)域相連。

④劃線用力大小要適當(dāng)，防止用力過大將培養(yǎng)基劃破。

（4）稀釋涂布平板操作：

稀釋涂布平板法則是將菌液進(jìn)行一系列的????????，然后將 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ??進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)稀釋倍數(shù)足夠高時(shí)，即可獲得單個(gè)細(xì)菌形成的標(biāo)準(zhǔn)菌落。

系列稀釋操作步驟：

①取盛有?????mL水的無菌試管6支????????，編號(hào)101、102、103、104、105、106。

②用灼燒冷卻的移液管吸取???mL菌液注入編號(hào)為101倍稀釋的試管中，并吹打3次使之混勻。

③從101倍液中吸取??????mL菌液注入到編號(hào)為102試管內(nèi)吹打均勻，獲得102倍液。依此類推。

3、菌種保存

(1)對(duì)于頻繁使用的菌種，可以采用??????????的方法。

將菌種接種到試管的固體????????????上，在??????的溫度下培養(yǎng)。當(dāng)菌落長(zhǎng)成后，將試管放入____的冰箱中保藏。以后每???????????個(gè)月，都要重新將菌種從舊的培養(yǎng)基上????????到新鮮的培養(yǎng)基上。

缺點(diǎn)：這種方法保存的時(shí)間不長(zhǎng)，菌種容易??????????或產(chǎn)生???????????????。

(2)對(duì)于需要????????保存的菌種，可以采用????????管藏的方法。

過程：在3mL甘油瓶中裝入1mL甘油→?????→將1mL培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)移至甘油瓶中，與甘油充分混勻→?????冷凍箱中保存。

【拓展提升】

【拓展1】培養(yǎng)基的類型及其應(yīng)用：

特別提醒：（1）加入培養(yǎng)基中的凝固劑（如瓊脂），一般不能被微生物利用，只起到凝固作用。（2）選擇培養(yǎng)基一般只生長(zhǎng)具有特定功能的微生物，鑒別培養(yǎng)基可以存在其他微生物，而且能鑒別特定的微生物。

【歸納總結(jié)】消毒和滅菌的區(qū)別（最根本區(qū)別是????????????????????）

項(xiàng)目	作用強(qiáng)度	結(jié)果	常用方法	應(yīng)用的范圍
消毒	較為???的理化因素		煮沸消毒法	一般物品
			巴氏消毒法
			化學(xué)藥劑
滅菌	????的理化因素		灼燒滅菌
			干熱滅菌
			高壓蒸汽滅菌	培養(yǎng)基及容器

【拓展2】生物的營養(yǎng)物質(zhì)及幾種微生物的營養(yǎng)能量來源[見表格]

植物的營養(yǎng)物質(zhì)：礦質(zhì)元素、水、二氧化碳等三類。人及動(dòng)物的營養(yǎng)物質(zhì)：水、無機(jī)鹽、糖類、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、維生素六類。微生物的營養(yǎng)物質(zhì)：水、無機(jī)鹽、碳源、氮源及特殊營養(yǎng)物質(zhì)五類。

碳源：如CO2、糖類、脂肪酸等有機(jī)物，構(gòu)成微生物的結(jié)構(gòu)物質(zhì)和分泌物，并提供能量。

氮源：如N2、氨鹽、硝酸鹽、牛肉膏、蛋白胨等，主要用來合成蛋白質(zhì)、核酸及含氮代謝物等。含有C、H、O、N的化合物既可以作為碳源，又可以作為氮源，如氨基酸等。

生長(zhǎng)因子：某些微生物正常生長(zhǎng)代謝過程中必須從培養(yǎng)基中吸收的微量有機(jī)小分子，如某些氨基酸、堿基、維生素等。

【課堂鞏固】

一、選擇題(每小題只有一個(gè)正確選項(xiàng))

1．下列關(guān)于培養(yǎng)基的敘述，錯(cuò)誤的是(???????)

A．碳源、氮源、無機(jī)鹽、水等是微生物生長(zhǎng)不可缺少的營養(yǎng)要素

B．根據(jù)微生物對(duì)碳源需要的差別，使用不同碳源的培養(yǎng)基

C．可在培養(yǎng)基中加入磷酸氫二鉀或磷酸二氫鉀，用于維持pH的相對(duì)穩(wěn)定

D．制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基的操作順序?yàn)橛?jì)算、稱量、溶化、倒平板、滅菌

2．下列所述環(huán)境條件下的微生物，能正常生長(zhǎng)繁殖的是(??????)

A．在缺乏碳源的培養(yǎng)基中的硝化細(xì)菌?????????????????????????B．在人體表皮擦傷部位的破傷風(fēng)桿菌

C．在新配制的植物礦質(zhì)營養(yǎng)液中的酵母菌??????????????????D．在滅菌后的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)液中的禽流感病毒

3．細(xì)菌培養(yǎng)過程中分別采用了高壓蒸汽、酒精、火焰灼燒幾種不同的滅菌處理，這些方法可依次用于殺滅哪些部位的細(xì)菌(??????)

A．接種針、手、培養(yǎng)基??????????????????????????????????????????????B．手、培養(yǎng)基、接種針

C．培養(yǎng)基、手、接種針??????????????????????????????????????????????D．接種針、培養(yǎng)基、手

4．牛肉膏可以為微生物提供的主要營養(yǎng)是(????)

A．氮源和維生素????????????????????????????????????????????????????????B．氫元素和氧元素

C．碳源、磷酸鹽和維生素??????????????????????????????????????????D．無機(jī)鹽

5．有關(guān)稀釋涂布平板法，敘述錯(cuò)誤的是?(??????)

A．首先將菌液進(jìn)行一系列的梯度稀釋

B．然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基的表面

C．其核心是防止雜菌污染，保證培養(yǎng)液的純度

D．結(jié)果都是可在培養(yǎng)基表面形成單個(gè)的菌落

6．用來判斷選擇培養(yǎng)基是否起到了選擇作用需要設(shè)置的對(duì)照是(??????)

A．未接種的選擇培養(yǎng)基 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?B．未接種的牛肉膏蛋白胨(全營養(yǎng))培養(yǎng)基

C．接種了的牛肉膏蛋白胨(全營養(yǎng))培養(yǎng)基???????????????????D．接種了的選擇培養(yǎng)基

二、非選擇題

7．炭疽病是由炭疽桿菌引起的一種人畜共患傳染病，炭疽桿菌兩端截平、呈竹節(jié)狀排列，菌落呈卷發(fā)狀，對(duì)炭疽病疑似患者，可根據(jù)噬菌體的宿主專一性，通過實(shí)驗(yàn)確診。

(1)細(xì)菌培養(yǎng)：采集疑似患者的樣本，分離培養(yǎng)，獲得可疑菌落。

(2)細(xì)菌鑒定：實(shí)驗(yàn)流程如圖所示。

①對(duì)配制的液體培養(yǎng)基等需采取????????????????方法滅菌；實(shí)驗(yàn)所用液體培養(yǎng)基的碳源為 ? ? ? ???(填“無機(jī)碳”或“有機(jī)碳”)。

②挑選可疑菌落制片后，用???????觀察，可看到呈竹節(jié)狀排列的桿菌。

③接種可疑菌后，35℃培養(yǎng)24小時(shí)，液體培養(yǎng)基變渾濁，原因是???????????????，對(duì)照組試管中應(yīng)加入??????????????，與實(shí)驗(yàn)組同時(shí)培養(yǎng)6小時(shí)后，若實(shí)驗(yàn)組液體培養(yǎng)基的渾濁度比對(duì)照組____(填“高”或“低”)，則可明確疑似患者被炭疽桿菌感染；反之則排除。

④對(duì)排除的疑似患者及易感人群，可接種炭疽桿菌疫苗，刺激機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)抗體。與產(chǎn)生抗體相關(guān)的細(xì)胞除T細(xì)胞、B細(xì)胞外，還有?????????、??????????。

8．某學(xué)校打算開辟一塊食用菌栽培基地，以豐富學(xué)生的勞動(dòng)技術(shù)課內(nèi)容。首先對(duì)食用菌實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行清掃和消毒處理，準(zhǔn)備食用菌栽培所需的各種原料和用具，然后從菌種站購來各種食用菌菌種。請(qǐng)回答：

(1)對(duì)買回來的菌種進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，首先制備試管培養(yǎng)基，寫出制備固體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基所需的原料?：???????、???????、????????、????????、????????。其中提供氮源的是??????????????????????。

(2)微生物在生長(zhǎng)過程中對(duì)各種成分所需量不同，配制培養(yǎng)基時(shí)各成分要有合適的???????。在燒杯中加入瓊脂后要不停??????，防止???????????????????????????。

(3)將配制好的培養(yǎng)基分裝到試管中，加棉塞后若干個(gè)試管一捆，包上牛皮紙并用皮筋勒緊放入 ? ? ? ??中滅菌，壓力100 kPa，溫度??????，時(shí)間15～30 min。滅菌完畢后拔掉電源，待鍋內(nèi)壓力自然降到0時(shí)，將試管取出。如果棉塞上沾有培養(yǎng)基，此試管應(yīng)?????????。

(4)使用高壓蒸汽滅菌鍋時(shí)注意，先向鍋內(nèi)倒入??????????，把鍋內(nèi)水加熱煮沸并將其中原有冷空氣徹底排出后將鍋密閉。

(5)從一支試管向另一支試管接種時(shí)注意，接種環(huán)要用酒精燈____(“內(nèi)”或“外”)焰滅菌，并且待接種環(huán)后蘸取菌種，試管口不能離開酒精燈火焰附近，將接種的試管放入____℃冰箱中保藏。

9．自然界中的微生物往往是混雜生長(zhǎng)的。人們?cè)谘芯课⑸飼r(shí)一般要將它們分離提純，然后進(jìn)行數(shù)量的測(cè)定。下面是對(duì)大腸桿菌進(jìn)行數(shù)量測(cè)定的實(shí)驗(yàn)，請(qǐng)回答有關(guān)問題。

步驟如下：

(1)制備稀釋倍數(shù)為102、103、104、105、106的系列稀釋液。

(2)為了得到更加準(zhǔn)確的結(jié)果，選用適宜的方法接種樣品：上圖是利用?????????????????法進(jìn)行微生物接種，把聚集的菌種逐步??????????分散到培養(yǎng)基的表面，為達(dá)到這一目的，操作上應(yīng)注意：?????????????????????????????????????????????????????????????????????????。

(3)適宜溫度下培養(yǎng)。

結(jié)果分析：

①測(cè)定的大腸桿菌數(shù)，在對(duì)應(yīng)稀釋倍數(shù)為106的培養(yǎng)基中，得到以下幾種統(tǒng)計(jì)結(jié)果，正確可信的是(???)

A．一個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)是230

B．兩個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)是220和260，取平均值240

C．三個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)分別是210、50和520，取平均值260

D．四個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)分別是210、300、240和250，取平均值250

②一同學(xué)在稀釋倍數(shù)為105的培養(yǎng)基中測(cè)得平板上菌落數(shù)的平均值為23.4，那么每毫升樣品中的菌落數(shù)是(涂布平板時(shí)所用稀釋液的體積為0.1mL)????????????????????。

③用這種方法測(cè)定密度，實(shí)際活菌數(shù)量要比測(cè)得的數(shù)量____，因?yàn)?????????????????????????????????。

④某同學(xué)在測(cè)定大腸桿菌的密度時(shí)發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基上還有其他雜菌的菌落，能否肯定該大腸桿菌的品系被污染了？為什么？

⑤分析下面培養(yǎng)基的配方：NaNO3、KH2PO4、NaH2PO4、MgSO4?7H2O、KCl、H2O。若此培養(yǎng)基用于培養(yǎng)分解尿素的細(xì)菌，則應(yīng)除去上述成分中的??????????????，并加入葡萄糖、????????????物質(zhì)。

⑥三位同學(xué)用稀釋涂布平板法測(cè)定同一土壤樣品中細(xì)菌數(shù)量。在對(duì)應(yīng)稀釋倍數(shù)為106的培養(yǎng)基中，得到以下統(tǒng)計(jì)結(jié)果：

甲同學(xué)涂布了兩個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)是236和260，取平均值248；

乙同學(xué)涂布了三個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)是210、240和250，取平均值233；

丙同學(xué)涂布了三個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)是21、212和256，取平均值163；

在三位同學(xué)的統(tǒng)計(jì)中，只有一位同學(xué)的統(tǒng)計(jì)是正確的，指出另兩位同學(xué)的統(tǒng)計(jì)為什么不正確？

參考答案：

一、選擇題1~6 DACCDC
二、非選擇題

7.(2)①高壓蒸汽(98kPa蒸汽)。②顯微鏡。③細(xì)菌大量繁殖，等量的生理鹽水，低。④吞噬細(xì)胞、效應(yīng)B細(xì)胞。

8.(1)牛肉膏、蛋白胨、水、無機(jī)鹽、瓊脂。蛋白胨、牛肉膏。(2)比例。攪拌，瓊脂糊底引起燒杯破裂。(3)高壓蒸汽滅菌鍋，121℃，廢棄。(4)適量水。(5)外，冷卻，4℃。

9.(2)平板劃線，稀釋，每次劃線前要灼燒接種環(huán)；冷卻后從上一區(qū)劃線末端開始劃；首尾區(qū)不重疊。

(3)①D。②2.34×108。③多，當(dāng)兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞連在一起時(shí)，平板上觀察到的是一個(gè)菌落。④不能；因?yàn)椴荒芘懦s菌來自培養(yǎng)基或來自培養(yǎng)過程的可能。⑤NaNO3，尿素。⑥甲同學(xué)只涂布了兩個(gè)平板，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)說服力不夠；丙同學(xué)其中一個(gè)平板的計(jì)數(shù)結(jié)果與另兩個(gè)相差太遠(yuǎn)，說明操作過程出現(xiàn)錯(cuò)誤，數(shù)據(jù)缺乏正確性。